卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation，IVM)技术是随着20世纪动物胚胎体外生产 (In VitroProduction，IVP)技术的产生和发展而兴起的，是胚胎工程的重要环节之一。Mattioli等(1989) 将鲜精用在体外成熟的猪卵母细胞体外受精、体外培养发育到2～4细胞并移到受体母猪中妊娠产仔，成为世界上首例用体外培养成熟的猪卵巢卵母细胞、鲜精体外受精移植后产仔的“试管猪”。目前，猪IVM、体外受精(In Vitro Fertilization，IVF)研究已经取得了一些进展，但成功率仍很低。猪IVP作为一项非常有发展前途的生物技术，其研究重点仍需放在探讨影响卵母细胞体外成熟的各种影响因子及早期胚胎发育方面。
 

　　猪卵巢卵母细胞体外成熟及其体外受精后支持发育的能力都比体内差，这说明体外成熟培养环境还远未达到体内的生理水平。卵母细胞体外成熟受到众多因素的调控，其调控机制十分复杂。猪受精卵体外培养过程的主要障碍是4-细胞期的发育阻滞，能否越过阻滞期主要在于早期胚胎4-细胞期是否被激活。本试验于2010年3月在江苏省农业科学院胚胎工程研究室进行，重点探讨不同培养时间、不同精子获能时间以及不同精卵共孵育时间对体外受精效果的影响，为开展猪胚胎发育生物学和种质资源保存研究提供参考。
 

　　一、 猪卵巢和卵母细胞的采集

　　卵巢以适量灭菌生理盐水冲洗3遍，用8号注射器抽吸直径3～5 mm卵泡的卵泡液于试管中，静置15 min后，取试管底部卵泡液于平皿中，实体显微镜下镜检，检出包被着3层或3层以上颗粒细胞的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，转移到已平衡好的TCM-199液滴中，清洗2~3次，洗去多余的卵丘细胞待体外成熟培养。
 

　　二、卵丘卵母细胞复合体(COCs)体外成熟培养(IVM)

　　卵丘卵母细胞复合体成熟培养在六孔培养板内进行。培养板孔内加 TCM-199 培养液 [含 10%FCS(胎牛血清)、10% pFF(卵泡液)、69 μg/mL L-Cys(L-半胱氨酸)、10 IU/mL PMSG(孕马血清)、10IU/mL hCG(人绒毛膜促性腺激素)]500 μL，以矿物油覆盖。选取平皿内形态学正常(胞质均匀、包被 3层或3层以上致密卵丘细胞) 的COCs，迅速转入CO2培养箱内已平衡好的培养液系统中，进行体外成熟培养(5%CO2的空气，饱和湿度，39 ℃)，间隔24 h换约一半培养液，40 h后于倒置显微镜下观察卵丘细胞扩散状态和第一极体排出情况。
 

　　三、成熟卵母细胞体外受精

　　做数个50 μL的mTBM受精滴然后盖上矿物油，放入CO2培养箱中隔夜平衡，挑取排出第一极体和胞质形态良好的成熟卵母细胞放入隔夜平衡的mTBM液滴中，每50 μL放约20枚卵。取回的新鲜精子取200 μL放入离心管1 500 r/min离心5 min后弃上清液，加入等量的PBS(磷酸盐缓冲液)离心洗2～3次后用mTBM洗1～2次，然后再用含肝素的mTBM清洗，之后放入CO2培养箱中获能，调整精子浓度1.6×106个/mL，等体积加入含有卵母细胞的mTBM中，精卵共孵育后转入预平衡的NCSU-23中继续培养。
 

　　3.1 不同培养时间卵泡卵母细胞体外受精卵裂率的差异

　　卵母细胞体外成熟培养24 h左右，进行体外受精基本上没有卵裂发生，偶尔有卵裂的也有可能是孤雌胚，体外成熟培养44 h左右，体外受精卵裂率最高达到41.3%。继续培养，体外受精后卵裂率下降，体外成熟培养74 h左右，进行体外受精，基本上没有卵裂现象。
 

　　3.2不同精子获能时间体外受精卵裂率差异

　　精子获能1.5 h左右，卵裂率最高达到46.3%;精子获能2 h以内，基本上不影响正常受精;精子获能2 h以上，卵裂率开始下降;获能3 h卵裂率下降到25%。
 

　　3.3不同精卵孵育时间体外受精卵裂率差异

　　体外受精精卵孵育4 h左右，就可以达到较好受精的效果。精卵孵育6 h左右受精效果最佳，卵裂率达到47.2%，精卵孵育8 h以上受精率开始下降，精卵孵育12 h，卵裂率仅有14.2%。
 

　　四、 讨论

　　(1)卵母细胞的成熟包括胞核成熟、胞质成熟和胞膜成熟。其中胞核成熟是一个复杂的过程，猪通常需要48 h左右才能达到核成熟，24 h的核成熟率几乎为零，培养36 h后，核成熟率达到最高值，但此时胞质成熟仍在继续，培养48 h后，核成熟率并不增高，但卵母细胞此时才完成与体内过程基本相同的胞质成熟过程。本试验发现，猪卵母细胞体外成熟培养24 h左右，进行体外受精基本上没有卵裂发生，随着培养时间的延长体外受精率上升;体外成熟培养44 h左右，体外受精卵裂率达到41.3%。继续培养，体外受精后卵裂率有所下降;体外成熟培养74 h左右进行体外受精，基本上没有卵裂现象。这说明卵母细胞的成熟程度对受精后卵裂情况至关重要，体外受精的时间应选取胞质和胞核都相当成熟的时间段来进行。胞核与胞质的不成熟和胞质的退化都会影响体外受精后的卵裂率。
 

　　(2)体外受精时，精子必须经过一系列生理变化才能具备使卵子受精的能力，称为体外获能。关于体外获能所需的时间，种间存在很大差异。一些种类获能最短时间为2 h，如小鼠和猫;另一些种类则需要7~8 h，如兔和人。这些不同很可能是由于精子质膜的物理和化学上的固有特性不同。即使从同一个体射出的精子，获能也并不是同时发生的，一些精子获能较快，另一些则较慢，即存在获能上的“异质性”或“非均一性”。本试验研究过程中发现，精子获能1 h以内，卵裂率低于获能1.5～2 h;精子获能2 h以上，受精率开始下降;获能3 h卵裂率下降到25%。精子获能是为顶体反应做准备的，如果精子在遇到卵子以前已经发生了完全的顶体反应，顶体酶过早释放，则可能被抑制因子或自身水解酶灭活，精子便失去穿透卵子的能力。若过早与卵子相遇，则会因获能不足导致卵裂率的下降。因此，适当的获能时间对于体外受精至关重要。
 

　　(3)不同的精卵相互作用时间对体外受精结果有着一定的影响，精卵作用时间太短，卵母细胞不能与精子充分结合，受精率会大大降低，精卵作用时间太长，异常受精现象增加，其虽能卵裂，但发育至桑葚胚、囊胚阶段能力差。本试验研究过程中发现，体外受精精卵孵育4 h左右，就可以达到较好受精的效果;精卵孵育6～8 h左右受精效果最佳，卵裂率达到40.0%以上;精卵孵育8 h以上受精率开始下降;精卵孵育12 h，卵裂率仅有14.2%。因此，精卵共同孵育6~8 h即应将卵子从受精液中移出，转入早期培养液中培养，这样做一方面是可将卵子尽快地从已死亡或濒临死亡的精子悬浮液中移出，以消除水解酶等对受精卵发育的不利影响;另一方面，受精时间太长，易导致多精子受精，反而可能影响受精卵以后的发育。