N-乙基-N-亚硝基脲(N-Ethyl-N-nitrosourea, ENU)是一种较强的基因诱变剂,能在相对较短的时间内诱导产生大量随机突变表型,进一步通过表型筛选及遗传试验可能获得具有特殊表型的突变系动物,可用于建立人类遗传性疾病研究的新模型,在一定程度上还可以作为验证基因功能的一种参考方法。ENU具有较大的细胞毒性,给药后往往会导致雄性实验动物生殖能力的下降甚至不育,目前ENU诱变的实验动物一般为小鼠,而小鼠的解剖与生理功能与人相差较大,并且小鼠的精液不易采集,很难对其生殖功能进行长期监控。猪的解剖与生理功能与人较为相似,特别是小型猪已成为医学实验上重要的实验材料。利用小型猪巴马香猪做为实验动物,通过ENU诱导建立大型哺乳动物基因突变模型和人类疾病动物模型,在理论和医学实践上均具有重要价值。小鼠诱变实验的结果表明,ENU剂量的选择十分重要,一个适宜的剂量不仅能诱导DNA突变,而且还要保障实验动物的生殖功能在停药后可以逐渐恢复,从而使获得的突变能够遗传下去。本研究针对ENU诱变过程适宜剂量筛选这一关键问题,在研究巴马香猪精液品质特征的基础上,长期监控ENU处理对公猪生殖功能的影响,筛选到了既能诱导可疑表型,又能保证在ENU停药后,公猪生殖功能能基本恢复正常的适宜剂量。试验首先检测了90头健康成年巴马香猪新鲜精液质量,并探索液冷冻保存的方法。成年巴马香猪射精量、精液活力、密度、畸形率、抗力指数分别为95.31m1,75.33%,0.78x108,5.13%及581,其中,巴马香猪的射精量、精子活力和密度均低于杜洛克和约克夏等商品猪。在巴马香猪精液冷冻研究中,采用正交实验设计,在探讨低密度脂蛋白(LDL)浓度、甘油浓度、海藻糖浓度作用的基础上,进一步结合15℃平衡时间和解冻方法对冷冻解冻后精子活率的影响,进行巴马香猪精液最佳冻存方案的优化。结果表明方案1(A3B4C2D3E1)为最佳方案,其解冻后精子活率为52.26%。为分析稀释液与冷冻液中LDL、甘油和海藻糖不同联用组合的保护效果,在方案1的基础上,共设计了4种组合,以精子运动能力、顶体完整性、质膜完整性以及DNA损伤率等为判定指标,结果表明,9%的LDL、200mM海藻糖与2%的甘油联用时(即组合4)显著优于其他组合的保护效果(P<0.05),并进一步证明方案1是巴马香猪精液冷冻保存的最佳方案。巴马香猪ENU给药当天各剂量组猪只采食量与对照组相比极显著地降低(P<0.01),然后逐渐(给药后第5-6天)恢复直至正常(与对照组无显著差异,P>0.05)；待第2周(次)、第3周(次)重复给药时,会出现同样的变化趋势。ENU给药期间巴马香猪采食量会受到较大影响,采食量的减少具有浓度依赖性,采食量恢复时间随剂量的增加而延长。给药后各剂量组公猪的生长速度都有一定程度降低。随ENU给药剂量的增加,巴马香猪的死亡率逐渐升高,可育率逐渐降低。结果表明,巴马香猪对85mg/kg及以下剂量可耐受。巴马香猪ENU给药后12月内射精量呈现先下降后上升的趋势,给药后第12月,65mg/kg及以下剂量组巴马香猪射精量基本恢复正常；75-105mg/kg剂量组射精量均不能恢复到给药前水平,但75mg/kg剂量组公猪射精量恢复情况好于85-105mg/kg剂量组公猪(P<0.05),85-105mg/kg剂量组公猪之间射精量无显著性差异(P<0.05)。巴马香猪精子活力先下降后上升,给药后第12月,45mg/kg和65mg/kg剂量组公猪精子活力能够恢复到给药前水平,75-105mg/kg剂量组公猪均不能恢复到给药前水平,75mg/kg和85mg/kg剂量组公猪精子活力恢复情况好于90-105mg/kg剂量组公猪(P<0.05),90-105mg/kg剂量组公猪之间精子活力无显著性差异(P<0.05)。巴马香猪精液密度也表现为先下降后上升,45mg/kg和65mg/kg剂量组公猪精液密度能够恢复到给药前水平,75-105mg/kg剂量组公猪均不能恢复到给药前水平,其中75mg/kg剂量组公猪精液密度恢复情况好于85mg/kg剂量组(P<0.05),后者精液密度恢复好于90-105mg/kg剂量组公猪(P<0.05)。巴马香猪精子畸形率先上升后下降,45mg/kg和65mg/kg剂量组公猪精子畸形率能够恢复到给药前水平,75-105mg/kg剂量组公猪均不能恢复到给药前水平,其中75mg/kg和85mg/kg剂量组精子畸形率恢复好于90-105mg/kg剂量组公猪(P<0.05)。给药后18月公猪射精量显著高于给药后12月(P<0.05),表明公猪副性腺的精浆分泌功能有所恢复,其他精液指标无显著差异,
