1、抑制细菌蛋白质的合成与其它的大环内酯类药物相同，替米考星主要通过抑制细菌蛋白质合成而起作用。通过与50S核糖体亚单位可逆性结合,抑制移位酶活性,影响核糖体的位移过程,阻碍肽链的延长和蛋白质的合成,属于生长期抑菌剂。当药物浓度为最小抑菌浓度的4倍以上时，替米考星具有杀菌作用。
2、与机体免疫系统协同作用科学研究发现，替米考星可通过以下三种途径与机体的自然免疫系统协同作用，强强联合。
(1) 在吞噬细胞中靶向聚集；
（2）伴随吞噬细胞向感染部位趋化性转移；
（3）替米考星从吞噬细胞中释放后杀菌。替米考星在体内的生物学分布具有高度的靶向聚集性。研究发现：替米考星在肺脏中的浓度是血清中浓度的10倍以上，在嗜中性粒细胞中的浓度是血清中浓度的40倍以上;在巨噬细胞内的浓度是细胞外浓度的50～75倍。Scorneaux 等学者发现体内51％～85％的替米考星可靶向聚集于巨噬细胞的溶酶体中。也就是说，当替米考星进入体内后，会迅速聚集于肺部，特别是肺部的巨噬细胞内。替米考星的靶向聚集性可能与pH值有关，其分子结构中有两个碱性的氨基基团，使其容易在酸性的巨噬细胞溶酶体中聚集。聚集于肺泡巨噬细胞的替米考星可与巨噬细胞协同作用。在正常状态下,肺泡巨噬细胞将细菌、支原体等吞噬后形成吞噬小体,然后与溶酶体融合，依靠溶酶体中的溶菌酶消灭病原体，但此机制常无法将全部病原杀灭。当替米考星存在时，吞噬小体与溶酶体融合后，病原体将在溶菌酶与替米考星的抗菌性的“双重所用”下被消灭，杀菌作用显著增强。替米考星不但可在猪巨噬细胞内聚集，还能在其内维持一定的时间，体外研究表明，当细胞外的替米考星已代谢完毕时，嗜中性粒细胞与巨噬细胞中的替米考星最少还能维持4小时。这也就意味着，在血清中的替米考星代谢完毕后，吞噬细胞内仍可存在有效浓度的替米考星，并对病原菌起作用。这可能是替米考星抗菌后效应的原因之一。Scorneaux等人还发现，替米考星还能增强巨噬细胞溶菌酶的产生量，从而增强巨噬细胞的杀菌能力。此外，替米考星可能会影响病原体对细胞的黏附作用。Thacker等人证实，高浓度的替米考星（2ug/L）能够抑制肺炎支原体对纤毛上皮细胞的粘附作用，但具体的机理尚未被完全清楚。
