摘要：伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的多种畜、禽及野生动物的一种以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。该病每年给业造成的损失达数十亿美元，目前对该病主要是以防制为主。随着基因工程技术的不断更新和发展，研制更加安全、有效的基因工程对该病的防治将会有重要的意义。文章对伪狂犬病基因缺失疫苗及活载体疫苗的研究进行了综述。
关键词： 伪狂犬病病毒；基因缺失疫苗；活载体疫苗
伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）可引起家畜和多种野生动物的伪狂犬病，临床上以的神经症状、严重的呼吸道疾病以及发生流产、死产和产仔数下降等症状为特征，耐过猪增重减慢。伪狂犬病是危害我国业发展最为严重的传染病之一。目前主要采用接种疫苗防制该病。
PRV是疱疹病毒科、疱疹病毒甲亚科、水痘病毒属的成员，与其同属的还有1型牛疱疹病毒（BHV-1）、马疱疹病毒（EHV）以及水痘带状疱疹病毒（VSV）。PRV基因组为线性双股DNA，约150 kb，由长独特区（U-L）和短独特区（US）及U S两侧的末端倒转重复（TR）与内部重复（IR）组成，可编码70种～100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白。在上述基因产物中，U L区段中的gC、TK及U S区段中的PK、gG、gI、11K和28K为病毒增殖的非必需成分，TK、gC、gI、PK和CP（衣壳蛋白）等与PRV毒力相关。TK基因缺失株的神经毒力明显降低，如果与其它的毒力基因（如gE）联合缺失时，PRV强毒即可变成为一个双基因缺失弱毒疫苗株[1]。
1 伪狂犬病基因缺失标记疫苗
伪狂犬病基因缺失疫苗的研制始于20世纪80年代初期，即利用基因工程技术在PRV基因组中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因不能表达，从而使PRV的毒力减弱，同时又保持其较强的免疫原性。
世界上第一个获得批准使用的基因工程缺失疫苗就是伪狂犬病TK缺失疫苗株BUK-d13，它是以PPV BUK株为起始材料，通过缺失TK基因序列的148 bp而获得[2]。BUK疫苗株是将其亲本病毒通过鸡胚细胞传代800代以上获得的，其US区的gE基因存在缺失。因此，BUK-d13除了TK基因缺失外，还有来自BUK疫苗株的gE缺失。该毒株在细胞培养物上，即使在含有HAT的选择条件下也不能回复为TK+。Kit S等[3] 在PRV BUK-d13株的基础上删除gC基因的1 100 bp片段，构建出了TK－/gE－/gC－ 的PRV gC /TK株。
Marchioli C C等[4] 和Van Zijl M等[5] 分别构建了缺失TK和gG基因的PRV疫苗株和缺失TK和gE基因的疫苗株（783株）。Mettenleiter T C等[6]报道，在建立表达PRV gD基因细胞系的基础上，从PRV的BamHI－7片段中缺失了5.1 kb的片段（含有gG、gD、gE、gI基因的编码序列），构建出了PRV的gG－/gD－/gE－/gI－的四基因缺失株PRV 376株。王琴[7] 构建了基于PRV Fa株的TK基因缺失株。
颜其贵等[8] 构建了PRV Fa gI－/gD－?基因缺失株，小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一定的免疫原性。周复春[9] 构建了一系列基因缺失株（PRV Ea TK－、TK－/LacZ+、TK－/gG－/LacZ+?等）。
Liu Z等[10] 将LacZ基因表达试剂盒插入到PRV Ea株基因组的gE区，通过蓝斑筛选和纯化，得到了TK－/gE－/LacZ+ PRV。利用LacZ基因处的Eco-RI酶切位点来消化PRV Ea TK－/gE－/LacZ+?基因组DNA，并与质粒pFBBS在PK-15细胞上进行共转染。经过蚀斑纯化得到了TK－/gE－/gD－ PRV。通过小鼠试验表明，此TK－/gE－/gD－ PRV的毒力明显减弱。
Shiau A L等[11] 介绍了一种简单有效的两步法来构建PRV gD缺失病毒株，并且可以在此区域插入外源基因。首先将人单纯疱疹病毒型（HSV-1）的TK基因插入到PRV的gD区域，该病毒为gD－/TK+ 株，可以在HAT培养基中进行选择。第二步则是用所需的外源基因来替代HSV TK基因区域。可以通过无环鸟苷来筛选gD/gE/TK基因缺失PRV。? 甲亚科疱疹病毒U L 46～49编码的衣壳蛋白十分保守，然而，这些蛋白对于α疱疹病毒复制的重要性却不尽相同。在PRV中缺失单独的U L 47或U L 48对PRV粒子的成熟和释放有一定程度的减弱作用。但是缺失U L 46或U～L 49对于PRV在细胞培养物中的复制没有显著的影响。Fuchs W等[12] 构建了U L 46～49四基因缺失的PRV-Delta U L 46～49，试验结果证实，此PRV缺失株与其亲本毒株相比，在细胞中的蚀斑形成能力大为减弱，病毒滴度减少了100倍，但是此基因缺失病毒能够在非互补的猪或兔肾细胞中进行增殖及传代。电镜观察证实，在细胞中PRV-Delta U L 46～49的衣壳形成及病毒粒子的释放没有影响。这表明U L 46～49编码的衣壳蛋白对PRV的复制并不是完全必需的。
四川农业大学的郭万柱主持的“猪伪狂犬（基因缺失）活疫苗（SA215株）”获得国家新兽药证书，从而成为我国第1株动物病毒基因工程疫苗，试验研究和大量实际应用效果表明，该疫苗较常规疫苗及同类疫苗具有遗传稳定性和安全性好、免疫原性强和抗潜伏感染能力独特等优点，达到国际同类疫苗的应用标准。华中农大的TK- /gG- /LacZ+已按新兽药证书的要求，完成了中试与区域试验，经动物实验和中试应用证明该产品在产生抗体的时间和保护效果优于目前的国内外同类产品。该项基因缺失疫苗和鉴别诊断方法的研究成功，为当前我国控制猪伪狂犬病和将来我国消灭此病提供了强有力的工具。
多种PRV缺失弱毒株的构建成功，为开发研制伪狂犬病基因工程疫苗奠定了坚实的基础，并已用于伪狂犬病的防制。基因缺失疫苗具有如下的优点：
（1）由于PRV基因缺失疫苗株都缺失了目的基因的几百甚至几千个碱基，缺失区域明确，所以它们返祖的可能性极小。PRV BUK-d13株在专门筛选TK＋ 病毒细胞介质中增殖，没有恢复TK活性。
（2）PRV基因缺失株都缺失1个或几个影响病毒毒力的相关基因，所以大多数的PRV基因缺失株对鼠和猪无毒力或仅有相当低的毒力，但是，仅缺失TK基因的弱毒株对犊牛还有较低的毒力，而对猫和狗毒力较强，若同时再缺失gC或gE基因，则几乎不表现毒力。大多数的PRV基因缺失疫苗株都有较强的免疫原性，免疫动物都获得了保护。强毒攻击免疫猪不出现临床症状，猪排毒时间大大缩短，排毒量大为降低。
（3）大多数PRV基因缺失疫苗株都不能侵入中枢神经系统或复制能力大大减弱，仅能在三叉神经节处复制，但与强毒株相比，复制水平已大大降低，难以建立潜伏感染。已证实，PRV弱毒株在三叉神经节的定殖能阻止强毒侵入中枢神经系统，也使强毒很难在其中潜伏。?
（4）PRV基因缺失疫苗株可以以缺失基因编码蛋白作为靶蛋白，建立敏感而特异的血清学检测方法，通过检测特异性抗体，将缺失疫苗免疫动物与野毒感染或常规疫苗免疫动物区分开来，以便对野毒感染动物采取针对性的防制措施[1]。
2 PRV载体疫苗
自1984年首次报道可以将HSV-1作为表达外源基因的载体以来，疱疹病毒作为载体得到了深入研究和广泛应用。PRV的基因结构和功能与单纯疱疹病毒的很相似，这就为PRV在载体方面研究提供了模型。Keeler C L等[13] 最早用PRV作为载体表达了g-β-半乳糖苷融合蛋白。Thomsen D R等[14] 在PRV gG基因的启动子下游插入人组织血纤维蛋白溶酶原激活物（tPA）编码的cDNA，并用免疫沉淀分析法和细胞培养中酶活性来检测出了表达的tPA。自此PRV活载体疫苗的研究就拉开了序幕。
2.1 以gD或gE基因缺失PRV为载体
Hooft van Iddekinge B等[15] 用PRV基因组中的糖蛋白gE基因作为一个插入位点，来表达猪瘟病毒（CSFV）的糖蛋白E1（现在称为E2）基因。重组病毒M401、M402、M403中外源基因的表达分别由PRV gD启动子、人巨细胞病毒（CMV）极早期启动子、PRV gE启动子控制；同时分别在各自的启动子下游都带有gG信号肽序列。用此3种不同 启动子构建的重组病毒进行动物实验表明，M402重组病毒产生了较好的免疫保护效果。
PRV的囊膜糖蛋白gD是病毒侵入靶细胞所必需的，病毒在细胞-细胞之间的传播则不需要gD。当动物接种表型互补的PRV gD－ 突变株时，病毒能够直接在细胞和细胞间转移，但是感染细胞释放的子代病毒无感染性，这主要是其缺失了gD基因。因此，这种gD基因缺失病毒不会散毒，不会从接种动物传染给其它动物，能够作为安全的活载体疫苗。Peeters B等[16] 为检验gD缺失的PRV能否成为生物安全活载体疫苗，以gD/gE基因缺失PRV D57为基础来构建了表达CSFV的囊膜糖蛋白E2的重组病毒，E2基因由CMV极早期启动子控制。动物实验表明，此重组PRV对猪有较好的免疫保护效果。
2.2 以gG或TK基因缺失PRV为载体
Mettenleiter T C[6] 将LacZ基因插入到PRV gG基因的启动子下游，把构建的转移载体与PRV基因组进行共转染，所产生的重组病毒可以通过蚀斑颜色反应来鉴定。GG-LacZ融合基因可以作为表达盒，插入到PRV基因组的其它非必需区域（如TK、gI区域等），从而导致这些被插入区域的失活。因此，糖蛋白gG-LacZ基因可作为快速鉴定重组PRV的插入标记，能够方便地分离及纯化重组病毒。
Van Zijl M等[5] 将CSFV E1基因插入PRV gG基因信号肽下游，获得融合表达E1基因的重组PRV。动物实验证实，此重组病毒可以保护SPF猪对致死性CSFV和PRV强毒的攻击。
Mulder W A M[17] 利用表达CSFV E1基因的重组PRV作为模式，来研究活疱疹病毒载体疫苗表达外源基因的安全性。用表达CSFV E1基因的重组gE－/gG－/TK－/E1+?株PRV进行动物实验证实，此重组病毒未改变对细胞和宿主的嗜性，也不改变毒力，且其散毒能力减弱。
在疱疹病毒基因组中，gI和gE基因所编码的囊膜糖蛋白是十分保守的。Knapp A C等[18] 以gI和gE基因缺失PRV为载体，构建了能够高效表达BHV-1的gI和gE基因的重组PRV（插入位点是gG区域）。实验证实，此重组病毒表达BHV-1（gI和gE）蛋白的水平与BHV-1相当，同时形成gE-gI复合体的能力也类似于BHV-1。并且最重要的一点为，此重组PRV所表达的BHV-1的gI和gE蛋白能弥补自身缺失的gI和gE基因的功能。
Xu G等[19] 构建了表达乙型脑炎病毒NS1基因的重组PRV株TK－/gG－/NS1+?。经检测，重组病毒能表达具有生物活性的NS1蛋白。该重组病毒有望作为猪乙型脑炎和伪狂犬病双价基因工程疫苗。
Qian P等[20] 将gG启动子控制下的口蹄疫病毒（FMDV）的VP1基因插入PRV基因组中的gG基因的N端下游，得到重组病毒PRV-VP1。免疫保护试验表明，用此重组病毒经免疫猪体后诱生了针对FMDV和PRV的抗体，然而其抗体滴度低于商品化的口蹄疫灭活疫苗。
田志军等以PRV Bartha-K61（gE－）为基础，获得的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因的TK－ /gE－/GP5+?重组PRV株（rPRV-GP5）。经动物实验证实，rPRV-GP5对伪狂犬病和PRRS产生了较好的免疫保护效果。同时建立了针对PRRSV N蛋白和PRV gE蛋白的鉴别诊断方法，为我国在猪群中控制和根除伪狂犬病和PRRS提供了技术支持。
此外，PRV的跨突触逆行作用在神经解剖学研究中具有十分重要的作用。最近在利用PRV重组病毒株表达不同的报告蛋白（绿色或红色荧光蛋白）来作为跨神经元标记的研究十分的广泛。然而，目前利用rPRV表达不同的报告蛋白，是由不同的启动子所启动，并插入到病毒基因组的不同区域，应用不同的方法进行检测就限制了此重组病毒在神经解剖学研究中的应用，目前，研究人员正在做这一方面的研究。
3 结语
一些国家通过应用PRV基因缺失疫苗和与之相配套的血清学鉴别诊断方法正在实施根除猪伪狂犬病的计划。现行的PRV基因缺失疫苗多为gE－表型，且许多国家只准使用gE－ PRV疫苗，因此发展以gE－为基础的基因缺失疫苗及其配套的鉴别诊断方法应是今后的发展方向。将PRV发展为一种基因转移载体在基因表达、载体疫苗研制、基因投递和基因治疗等多个方面将会有广泛的应用前景。同时将PRV作为一种良好的疫苗载体，可以研制预防猪传染病的系列化二价、多价基因工程疫苗。相信在不久的将来，只有易于被感染相鉴别的疫苗才可获准上市，用于动物接种，而伪狂犬病重组疫苗正符合这一趋势。
