基本原理
原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。
PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，经过模板的变性、退火和引物延伸三种循环，将引物引导下的特异性靶序列迅速地进行扩增，经过扩增的靶序列(一般能扩增106倍)，很轻易在凝胶电泳或Southern印记杂交中显示出来，因此，PCR技术具有灵敏度高，特异性强的上风，随着热循环自动化的进步与稳定也使得PCR技术的操纵简便易行。但是，PCR技术是在液相中进行的，在扩增前，需将细胞破坏，从中提取核酸作为模板，因此很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来，同时，也很难判定含特异性靶序列的细胞类型。
原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来，保持了两项技术的上风又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进进细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保存在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很轻易被原位杂交技术检查。
基本类型
根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类，此外，还有反转录原位PCR技术等。
直接法原位PCR技术
直接法原位PCR技术是将扩增的产物直接携带标记分子，即使用标记的三磷酸腺苷或引物片断。当标本进行PCR扩增时，标记的分子就掺进到扩增的产物中，显示标记物，就能将特定的DNA或RNA在标本(原位)中显现出来。
常用的标记物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自显影的方法或用亲和组织化学及免疫组织化学的方法往显示标记物所在位置。
直接法原位PCR技术的优点是操纵简便，流程短，省时。缺点是特异性较差，易出现假阳性，扩增效率也较低，特别是在石蜡切片上，上述缺点更为突出。由于在制片过程中，无论是固定，脱水还是包埋，都会导致DNA的损害，而受损的DNA可利用反应体系中的标记三磷酸核苷进行修复，这样标记物就会掺进到DNA的非靶序列中，造成假阳性。若用标记引物的方法进行直接法原位PCR，其扩增的效率比不标记更低。
间接法原位PCR技术
间接法原位PCR技术师现在细胞内进行特定DNA或RNA扩增，再用标记的探针进行原位杂交，明显进步了特异性，是目前应用最为广泛的原位PCR技术。
间接法原位PCR与直接法不同的是，反应体系与常规PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不带任何标记物。即实现先扩增的目的，然后用原位杂交技术往检测细胞内已扩增的特定的DNA产物，因此，实际上是将PCR技术和原位杂交技术结合起来的一种新技术，故又称之为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization , PISH)。
间接法PCR技术的优点是特异性较高，扩增效率也较高。缺点是操纵步骤较直接法繁琐。
原位反转录PCR技术。
原位反转录PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是将液相的RT-PCR技术应用到组织细胞标本中的一种新技术，与RT-PCR(液相)不同点在于，进行原位反转录PCR反应之前，组织标本要先用DNA酶处理，以破坏组织中的DNA酶，这样才能保证扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA，而不是细胞中原有的DNA。其它基本步骤与液相的RT-PCR相似。
基本步骤
原位PCR技术的基本步骤包括标本的制备。原位扩增(PCR)及原位检测等基本环节，现分述如下(重点以石蜡切片为例)。
标本的制备
原位PCR技术可应用于细胞悬液、细胞涂片、冰冻切片以及石蜡切片。相比较而言，以悬浮的完整细胞做原位PCR效果最好，石蜡切片效果最差。随着技术方面的一些题目被解决，近年也有从石蜡切片中得到满足的PCR效率的报道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，热传导较差，热对流不均匀，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更为主要的原因，可能是标本经制片后，细胞缺乏完整的胞浆或核膜，扩增产物易发生弥漫而导致扩增的产物在原位不易保存。尽大多数的病理标本都是以福尔马林固定，石蜡包埋的形式保存的，若能很好地解决石蜡切片原位PCR的有关技术题目，意义显然是十分重大的。
组织细胞的固定 一般以为组织细胞以10%的缓冲福尔马林或4%的多聚甲醛固定后进行原位PCR效果较好。固定的时间一般不宜过长，视组织的大小，一般以4℃4-6小时为宜。
