一、实训内容

1、猪支原体病的临床诊断方法。

2、猪支原体病的实脸室检测方法及结果判断。

二、仪器和材料

1、仪器：恒温培养箱、接种环、吸管、酒精灯、纯水机、试管、培养皿、、高压灭菌器、三角瓶、量筒、烧杯、漏斗、电炉、天平、棉花、纱布、玻瑞棒等。

2、材料：Goodwin氏培养基，青霉素，马血清培养基，姬姆萨染掖，pH值7.2、0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS液），绵羊红细胞，燕馏水等。

三、实验室诊断

1、触片直接镜检

（1）病料采集：取病猪病变明显的肺炎病灶与健康肺交界处肺切面或细支气管上皮细胞绒毛部部位、鼻、喉、气管分泌物、胸腔渗出物、泌尿生殖道分泌物、乳汁、关节液、纵隔淋巴结等，立即接种或置于液体培养基中4℃保存备用。

（2）制片：无菌采取病料2cm³大小，修成光滑的平面后，取载玻片轻触3次制成触片，干操后用甲醇2~5min。

（3）染色：用PH值7.2、0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(p日s液》将嫩姆萨染液稀释20倍。染色3h，冲洗、干燥后，立即用丙酮清洗1次后镜检。

（4）镜检：可见到深紫色球状、环状、轮状、伞状、两极状等形态的微生物。

2、病原休的分离培养

（1）培养基制作：支原体在人工培养条件下很难生长，对营养要求极为苛刻。目前国内最常用的培养基有：

Goodwin氏培养基

配方：

灭菌Hartey氏消化肉汤 300.00mL

无菌灭活猪血清  200.00mL

灭活0.5%乳蛋白水解物亨氏液   500.00mL

灭菌酵母浸液  5.00mL

配制：除上述基础成分外，还要加青霉素200U/mL、醋酸铊0.125g/1000mL。用无菌的3.5%碳酸氢钠（NaHCO3）先溶于水解乳蛋白亨氏液中，高压灭菌；而其他物质除青霉素外则放在56℃的水浴锅中保持恒温状态，待琼脂冷却至56℃左右时再将各种成分混匀，倒入平板培养基内。

马血清培养基

配方：

灭活营养肉汤（加牛肉浸膏适量）   100.00mL

醋酸铊0.10g   

青霉素（800IU） 0.80g

无菌马血清  25.00mL

配制：先将营养肉汤熬制好后，再加入其他成分（马血清除外）。高压灭菌后。待温度降到56℃时加入无菌马血清，混匀后无菌条件下分装于灭菌试管中，塞上胶塞备用。

（2）接种：取病猪的病变明显的肺炎病灶与健康肺交界处肺切面或细支气管上皮细胞绒毛部部位。剪下面积1~2cm²大小，用Hank’s液洗涤1次后径泡于培养基中，37℃培养48h。当培养基pH值发生明显变化或观察培养基出现均匀混浊时，应将上述培养物以1:5比例接种于新鲜培养基中传代4~5代以后，再以1：10的接种量传代培养，一般传代6~7代，可直接用培养物涂片染色镜检（其方法同触片检查）。

（3）培养：将处理好的病料置于合适的液体培养基中，置于5%~10%的环境中，37℃培养2~7d或更长时间（初次培养2~3周），待液体培养变为黄色时，再移植到合适的固体培养基中，CO2培养箱（高湿环境中）培养后，涂片、染色镜检。

3、生理生化试验

支原休的生化试验有多种，常用的有以下几种：

（1）溶血试验：在生长有支原体的平板上，加一薄层含绵羊红细胞的盐水琼脂，置于37℃培养过夜后，取出观察在菌落的周围出现β溶血环可确诊。

（2）生长抑制试验：先将可疑的支原体菌落连琼脂一同取出，接种于液体培养基中，37‘℃培养箱中培养1周后，取0.3mL均匀涂布在固体培养基上，然后在平板表面放直径6~8mm的圆纸片，再将培养基置于37℃培养箱中培养2~4周。纸片周围出现抑菌环（与药敏纸片相同）可以确诊为猪肺炎支原体。

4、微量间接血凝实脸

实验用市售猪支旅体检测试剂盘进行猪支原体肺炎的实验室诊断，简单、易行、特异性强、容易操作、敏感性高、菌落形态、菌体形态特征、染色等只能参考，不能作为确诊的依据。通常以血清学试验和致病性试验为主要诊断依据。