材料与方法
 

　　病料
 

　　来自华南某集约化猪场(2000头基础母猪)3～7日龄的乳猪5头，全场乳猪发生严重腹泻，传播迅速，发病率90%、死淘率90%以上。采集发病猪的小肠，按1：5研磨制备成病料，-80℃冻存待检。
 

　　主要试剂
 

　　RNA抽提试剂盒购于上海A公司，反转录酶、RNA 酶抑制剂、dNTP、18T载体克隆试剂盒、DL2000 DNA Marker、胶回收试剂盒、DH5α感受态细胞等购自TAKARA公司。
 

　　引物设计与合成
 

　　本实验室根据GenBank 所发布的序列号，选择N基因，运用Primer Premier5.0分别针对PDCoV、PEDV、TGEV、和RTV(猪轮状病毒)设计4对引物，由B公司合成，预计扩增的特异性基因片段大小为482 bp、450 bp、810 bp 和620 bp。
 

　　总RNA 的提取
 

　　病料经离心取上清液，按照ANYGEN 核酸提取试剂盒说明书提取病毒总RNA，然后用物RNA 酶的水溶解，放在-80℃保存。
 

　　RT-PCR 的检测
 

　　反转录体系：ddH2O 4 μL，下游引物R 1μL，RNA1μL，70 ℃水浴10 min 冰浴2 min ;5×MLV buffer 2μL，ddH2O 1μL，dNTPs 0.5μL，RNA 酶抑制剂 0.25μL，MLV 反转录酶 0.25μL，42 ℃水浴1 h，72 ℃水浴15 min冰浴至冷却。PCR 体系：ddH2O 32.5μL，10×MLV buffer 5μL，dNTPs 4μL，F 2μL，R2μL， cDNA 4μL，rTaq 0.5μL。反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30Cycles ，72 ℃ 7 min，PCR 反应产物于1.0% 琼脂糖凝胶电泳。
 

　　克隆
 

　　将阳性PCR 产物经纯化回收后与PMD-18T 载体连接，转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，培养后挑单个菌落进行PCR 鉴定，鉴定成功的重组质粒送往B公司进行测序。
 

　　序列分析
 

　　将RT-PCR 扩增获得的N 基因进行克隆、测序， 利用MEGA6 软件处理，与GenBank 上已公布的PDCoV 毒株的N 基因序列(表1)进行同源性比对分析，并绘制系统进化树。
 

　　结果与分析
 

　　病猪症状和病变
 

　　该集约化猪场5至15日龄乳猪发生传播迅速的严重腹泻，迅脱水死亡，死淘率高达90%以上。症状见剖检病变见图1和图2。主要在小肠,肠管明显扩张, 内充满黄色液体, 肠壁变薄、松弛、小肠黏膜充血, 肠系膜呈索状充血。

       4种病毒N 基因扩增
 

　　应用RT-PCR 方法对样品进行了PEDV/TGEV/RV/PDCoV 检测，结果显示PEDV/TGEV/RTV 未能扩增出目的条带，而PDCoV 扩增出与预期大小一致片段，约482 bp，电泳图见图3。检测结果显示该病料PEDV/TGEV/RTV 为阴性，PDCoV 为强阳性，说明该猪场可能存在PDCoV 的感染。
 

　　PDCoV N 基因序列分析
 

　　由测序结果可知，Ch-A测序的N 基因中间存在一个核苷酸的缺失、几个突变。运用DNAstard 软件将测序正确PDCoV N 基因序列与GenBank 上已发表的国内外毒株N 基因参考序列进行同源性比对分析，结果显示获得PDCoV 毒株N 基因之间的核苷酸序列同源性为98.3%到100%，氨基酸序列同源性为95.0%到100% ;其中TX 与中国已公布毒株相比核苷酸同源性为98.3%到99.0%，氨基酸同源性为95.0% 到96.9%，显示与中国香港毒株HKU15-155 同源性最低;与韩国和美国毒株相比核苷酸同源98.8%-99.0%，氨基酸同源性为96.2% 到96.9%。

   　PDCoV N 基因遗传进化分析
 

　　运用MEGA 6.06 软件绘制N基因系统进化树，结果表明我国新出现的猪丁型冠状病毒(Ch-A)与国内外报道的猪丁型冠状病毒亲缘关系较远，它单独在一个新的分支上。说明这是在我国新发现的一个新毒株(结果见图6)。
 

　　讨论
 

　　自2013年至今，新出现的PEDV 和PDCoV 已遍布美国，造成大量猪死亡。目前国际上正在形成该病毒相关研究热点，也发表了少量的报告。但国内至今未见该病毒为主因在猪场暴发和流行的报道。
 

　　我们首次报道了国内集约化猪场暴发猪丁型冠状病毒病。通过设计4对冠状病毒引物，在检测PEDV、TGEV 和RTV为阴性后，进一步设计引物扩增PDCoV，显示为强阳性。对PDCoV HN 株的N 基因进行测序，并与国内外已公布的序列进行系统进化树分析。

       结果显示：该PDCoV 毒株(Ch-A)与GenBank 上公布的美国株及中国株不在一个分支上，是新发现的一株新型冠状病毒病。该分支的毒株是否与本次发病的高致病力有关值得深入研究。仍然未知该病毒是怎么传入我国及其在我国各地的感染情况。
 

　　老病未消除、新病涌现，需高度重视和立即加强研究对猪丁型冠状病毒的监测和系统性研究，降低给养猪业带来的损失和威胁。