1 材料与方法
 

　　1.1 材料
 

　　1.1.1 主要诊断试剂
 

　　PEDV检测胶体金购自Bionovet公司;RNA提取试纸盒购自北京天恩泽基因科技有限公司;RNA反转录试纸盒购自美国Thermo Scientfic;PCR MIX购自北京擎科新业生物技术有限公司。引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。
 

　　1.1.2 样品
 

　　收集攻毒后实验猪的腹泻粪便与唾液，以及攻毒前后攻毒猪血清。
 

　　1.2 方法
 

　　1.2.1 返饲及采样方案
 

　　1)返饲前病料处理：取PEDV阳性初生仔猪肠道以及内容物300 g，经病原检测无猪瘟、猪伪狂犬和蓝耳病病原后，加入300 mL含青链霉素各60万单位的生理盐水，用组织捣碎机匀浆，取1 mL匀浆后的病料于-80 ℃保存，配合荧光定量PCR 测定返饲病料中病毒的拷贝数，返饲病料及时保存于4 ℃，并在1 h内进行返饲。
 

　　2)返饲：猪舍提前3 d彻底消毒，并用大量清水将猪舍冲洗干净，为了促进猪发生腹泻，在生猪运输前不控料、运输到实验室后马上进行返饲，并且不进行控料和胃肠功能调理工作。用保定绳对猪上颚进行保定，并抬高猪的头部，每头猪缓慢灌服100 mL返饲病料，灌服时不断轻轻揉捏猪喉头，加快猪的吞咽动作避免浪费。
 

　　3)返饲后饲养管理：6头猪分为3栏饲喂(栏舍宽2 m，长2.5 m)，攻毒期间打开猪舍内两个吊扇(美的牌屋顶式吊扇调至最高档)，返饲期间气温为19～25 ℃，返饲后每天早上8点到夜晚10点，每隔3 h用冷水冲洗猪舍与猪臀部，返饲后第4天停止对猪与猪舍凉水冲洗，并关闭猪舍内的吊扇。腹泻期间让猪只自由采食，腹泻第2天在饲料中添加适量的红糖与食用盐，腹泻好转后每天分2次饲喂，并停止使用红糖与食用盐，攻毒后第6天给生猪饲喂含益生菌的饲料添加剂，调节胃肠道功能。
 

　　4)样本采集：腹泻期间每隔3 h收集一次腹泻粪便并做好标记，腹泻好转后每隔7 d收集一次粪便和肛门拭子，并用唾液收集条采集唾液，样本收集后全部保存于-80 ℃冰箱中。
 

　　1.2.2 病原检测
 

　　1)将攻毒后生猪第一次腹泻的粪便进行收集，并用韩国金诺生产的胶体金PEDV检测试剂盒按说明书进行检测;
 

　　2)将攻毒后第3天与第6天6头猪腹泻粪便，以及攻毒后第15天6头猪的唾液与肛门拭子。分别按照RNA提取试剂盒与RNA反转录试剂盒说明书，采用RT-PCR方法检测PEDV，同时对攻毒后第3天的腹泻样品用荧光定量PCR测定病毒的CT值与拷贝数。
 

　　1.2.3 血清抗体检测
 

　　攻毒后每隔4～7 d对猪耳缘静脉采集一次血清，将采集的血清按本实验室建立的方法，进行PEDV IgG、IgA抗体检测。
 

　　2 结果
 

　　2.1 攻毒后第一次腹泻粪便PEDV胶体金检测结果
 

　　在攻毒后第2天有5头猪发生腹泻，第3天6头猪全部发生腹泻，取攻毒后第一头腹泻猪的粪便进行PEDV检测，结果在胶体金的质控带与检测带都出现了阳性条带，说明攻毒后第1头腹泻猪的粪便为PED阳性，部分检测结果见图1。

　　2.2 攻毒后第3天腹泻粪便PEDV RT-PCR检测结果
 

　　分别采取6头猪攻毒后第3天的排泄物，经RT-PCR (30循环)检测，各个样品在477 bp处均有一条特异性条带，说明6份样本PEDV检测均为阳性(图2)，攻毒后第6天的腹泻粪便检测带信号稍弱一些，攻毒后第15天收集的唾液与粪便棉签PEDV全阴性。

　　由图1的结果可知，在第1头腹泻猪的粪便中可检测到PEDV，故在图2中没有设置阳性对照样品，攻毒后第3天猪腹泻粪便经RT-PCR检测中条带很亮，可以说明6头猪已全部感染PEDV并出现排毒;而攻毒后第15天的唾液与粪便棉签检测全阴，说明6头猪体内已无PEDV。
 

　　2.3 返饲病料与部分腹泻样品荧光定量PCR检测结果
 

　　利用荧光定量PCR检测技术，分别对返饲病料与攻毒后第3天6头猪的腹泻粪便进行检测，其病毒检测的CT值与拷贝数如表1所示。

　　2.4 血清抗体IgA、IgG检测结果
 

　　将攻毒前后6头猪所采集血清分别进行PED抗体检测,并求出血清中IgA与IgG平均 OD值，结果见表2、图3。由表2和图3可见在攻毒后11 d猪血清中IgG抗体明显上升,并在攻毒后第20天IgA与IgG检测值均达到峰值。

　　3 分析与讨论
 

　　国外猪场在发生PED时，通常采用返饲技术控制了疫情，例如美国在2013年暴发PED，就是采取返饲措施及时控制了疾病，而国内猪场很少有成功利用返饲的案例，可能主要有2个方面原因的影响，一方面说明部分猪场在返饲的技术上缺乏正确的指导方案;另一方面暗示着部分猪场担忧返饲的安全性。
 

　　目前国内虽有上市的PEDV弱毒疫苗，但是效果仍在观察中，并且不能口服免疫，在这种情况下，返饲可作为一种选择。国外也有学者研究PEDV的攻毒实验，例如：在De Arriba ML PEDV接种试验中，仔猪的腹泻持续时间平均时间为1.7 d，持续排毒时间平均为5.4 d 。由于本试验为了模拟寒冷的天气，对攻毒猪采取了冲凉水与风扇降温，从而使本试验猪腹泻时间比De Arriba M L接种PEDV的试验猪要长，根据各个猪场饲养管理的不同,腹泻持续时间不等,一般在腹泻一周以内逐渐好转。临床上在促进猪群同期感染后，还需采取适当措施避免腹泻过度，例如对母猪返饲后，可通过加强隔离与消毒，改善环境温度与控制饲喂量，以及在饲料中添加一些微生态制剂，可以缩短母猪腹泻与排毒时间，并且同样能达到返饲效果。
 

　　由于试验动物是育肥后期猪，每次冲水就有猪站立排粪，能清楚的记录腹泻时间与对应猪编号，使数据更加准确。虽然本试验不能确定母猪攻毒后第几天停止排毒，但是可以明确母猪在攻毒后临床表现腹泻症状时，就开始向外界排毒，并且在攻毒后15 d的唾液与粪便中无PEDV。然而临床上攻毒15 d后，对攻毒猪仍然不能掉以轻心，在4 ℃ pH=5～9的条件下，PEDV可在污染的泥土中至少存活28 d，由表1可知，返饲后第3天腹泻粪便中病毒的拷贝数与返饲病料相当，说明猪舍环境中可能有大量病毒粒子的存在，为了防止PEDV在猪场的传播，母猪在攻毒后需对猪只体表与猪舍加强消毒，及时处理腹泻粪便，可以降低病毒感染其他猪群的风险。
 

　　由图3可知:母猪在攻毒后抗体在11～30 d，血清中IgA与IgG的抗体滴度维持在较高的水平，结合试验猪攻毒后第15天排泄物病原检测结果。对于母猪的返饲工作，可在其妊娠期的84到99 d之间进行返饲，尤其是对于一些正在发生PED的猪场，可对所有处于产前15 ～30 d的妊娠母猪进行返饲，能够及时地减少损失。这一观点也与Olanratmanee E得出的结果相符合，用7 201头母猪在产前不同时期进行返饲，其中返饲对妊娠61～90 d母猪的流产率最低。
 

　　刘秋菊用16头60日龄左右的仔猪做攻毒试验中，仔猪IgG抗体在攻毒后第16天达到最高，其检测OD均值为1.0左右。根据图3所示，在攻毒后第42天母猪的血清IgG抗体OD均值为0.98，尽管在PEDV防治措施中，主要靠肠道的黏膜免疫(IgA抗体)，但初乳中若含有较高滴度的IgG抗体，对仔猪同样具有保护作用，由此推出：母猪在返饲后的第11～42天，初乳中的抗体对哺乳仔猪有一定的保护作用，为了延长返饲后抗体保护时间，可在返饲后30～42 d进行组织灭活苗的加强免疫。
 

　　在过去的十年里，泰国也推荐利用返饲来扑灭商业猪群暴发的PED。返饲是一把双刃刀，并不是所有场都适合返饲，必需在配合实验室检测的条件下，确定返饲病料中无猪瘟、伪狂犬与猪蓝耳病病原，才可利用返饲控制PED在本场的流行。